僅供研究使用

 雞V型膠原α2(COL5α2)ELISA試劑盒

90分鐘一步法ELISA試劑盒可以適用于、、組織勻漿、細(xì)胞上清液等樣本類型。這些樣本可以用于檢測、和其他微生物等病原體，以及、自身性等病理情況。同時，ELISA試劑盒還可以用于檢測濃度、維生素等營養(yǎng)，以及污染物等有害的殘留量。需要注意的是，不同樣本類型和檢測項目可能對ELISA試劑盒的靈敏度和特產(chǎn)生影響，因此在選擇使用ELISA試劑盒時需要根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。

ELISA試劑盒的操作步驟如下：1.包被：用PH9.6的CBS包被液稀釋包被抗原至5μg/ml，酶標(biāo)板中每孔加入50μl，室溫、4℃或37℃過夜包被。2.洗滌：棄包被液（拍干，再用無塵紙吸干），用PH7.2-7.4的1×PBST洗滌液洗板3次（每孔均要加滿），每次3min~5min。3.封閉：每孔加封閉液（1%BSA）250μl，37℃封閉2h。4.洗滌：用1×PBST洗滌液洗板3次，每次3min~5min。5.結(jié)合一抗：用1×PBST緩沖液1∶1000稀釋被檢，每孔100μl，要設(shè)立陰性對照，37℃孵育1.5h。6.洗滌：同上。7.結(jié)合酶標(biāo)二抗：每孔加1×PBST緩沖液1000倍稀釋的酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG-HRP（稀釋倍數(shù)根據(jù)產(chǎn)品不同有所不同，可按說明書進(jìn)行）50μl，37℃孵育1h.8.洗滌：同上。9.顯色：每孔加底物溶液（TMB）50μl，置室溫避光顯色10min。10.待顯色后，每孔加入50μl終止液（2mol/L H2SO4）終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀讀取450nm的OD值，以確定水平。以上步驟僅供參考，具體操作請根據(jù)實際情況和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

試劑盒操作步驟：

   實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。 為實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的品溶液。

2.棄去，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記加99μl生物素標(biāo)記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時可見品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

雞V型膠原α2(COL5α2)ELISA試劑盒

ELISA試劑盒的用法包括以下步驟：1.包被：用PH9.6的CBS包被液稀釋包被抗原至5μg/ml，酶標(biāo)板中每孔加入50μl，室溫、4℃或37℃過夜包被。2.洗滌：棄包被液（拍干，再用無塵紙吸干），用PH7.2-7.4的1×PBST洗滌液洗板3次（每孔均要加滿），每次3min~5min。3.封閉：每孔加封閉液（1%BSA）250μl，37℃封閉2h。4.洗滌：用1×PBST洗滌液洗板3次，每次3min~5min。5.加樣：加入已經(jīng)稀釋好的樣品，37℃反應(yīng)1h。一般樣本加入50-100μl，充分混勻。6.洗滌：用洗滌液洗板3次，每次3min~5min。7.加入酶標(biāo)試劑：每孔加入100μl酶標(biāo)溶液，37℃，1h。8.洗滌：用洗滌液洗板3次，每次3min~5min。9.顯色：每孔先加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，37℃避光10-15min。10.終止及測定：加入50μl終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值。

標(biāo)本的采集及保存：

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  ：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
  

  
  


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  ：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
  

  
  


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  細(xì)胞物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 (注：標(biāo)本溶血會影響**檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。)
  

  
  


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  標(biāo)本的稀釋原則：通過文獻(xiàn)檢索的了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
  

  
  


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  品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。 如配制150 pg/ml品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
  

  
  


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  生物素標(biāo)記的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記加990μl生物素標(biāo)記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制。
  

  
  


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  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用小時內(nèi)配制
  

  
  

注意事項：

1.當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2.洗滌非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3.一次加樣時間**控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，建議使用排槍加樣。

4.請每次測定的同時做曲線，做復(fù)孔。

5.如標(biāo)本中待測含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請乘以稀釋倍數(shù)。

6.在配制品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7.底物請避光保存。

8.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

試劑盒性能

1．準(zhǔn)確性：品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2．靈敏度檢測濃度小于10 pg/ml。

3．特：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4．重復(fù)性：批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和15%。